Tracking von Nervenzellen im Cerebellum des Zebrafisches

(Tracking of Nerve Cells in the Cerebellum of the Zebra Fish)

Martin Storath

Zentrum Mathematik, TU München

Projekt, Wintersemester 2006/2007

Kurzbeschreibung

Im Rahmen dieses Projektes entstand die Software MasTracker zum automatischen Tracking von Zellen in Bildsequenzen, die insbesondere Zellteilungen erkennt, stabil gegenüber Bildrauschen ist und anpassbare Ergebnisauswertungen bietet.

Short Description

During this project work, the software MasTracker for automatic tracking of cells was developed. MasTracker is capable of detecting cell divions, robust to noise and easy to adapt concerning evaluation of results. Motivation Zum besseren Verständnis der embryonalen Entwicklung von Zebrafischen ist es notwendig, quantitative Informationen über Zellmigrationen zu erhalten. Dazu werden Bildsequenzen der Zellen der sich entwickelnden Zebrafische aufgenommen und ausgewertet. Eine manuelle Analyse ist aufgrund der Menge der entstehenden Bilddaten sehr zeitaufwendig, deswegen entstand der Wunsch nach einer automatischen Trackingsoftware. Die Projektarbeit wurde auf Anregung und in Kooperation mit dem Institut für Entwicklungsgenetik des Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit in Neuherberg durchgeführt, die auch freundlicherweise die Zellbilder zur Verfügung stellten.

Entstehung der Bilder

Im Labor werden bestimmte Zellen von Zebrafischembryonen durch Proteine fluoreszierend markiert, so dass diese bei Anregung durch Laserlicht leuchten. Ein konfokales Lasermikroskop ermöglicht es, Stapel von Bildern sehr dünner Querschnitte durch die Embryonen aufzunehmen. Die Entwicklung der Fische wird über einen Zeitraum von ca. 10-20 beobachtet und 5 mal pro Stunde ein Bildstapel aufgenommen. Bei einer Stapelgröße von 30 Bildern in jedem Zeitschritt, ergeben sich damit 600 bis 1200 Bilder pro Versuch.

Mathematisches Trackingverfahren

Im Rahmen der Projektes wurde die Trackingsoftware MasTracker als Plugin für das Open-Source Programm ImageJ entwickelt, die es ermöglicht, automatisch die Bewegungen der Zellen zu erfassen und quantitativ auszuwerten. Der verwendete Trackingalgorithmus ist im Wesentlichen eine 2D-Adaption des 2005 erschienenen 3D-Trackingalgorithmus "Segmenting and Tracking Fluorescent Cells in Dynamic 3-D Microscopy With Coupled Active Surfaces" (Alexandre Dufour et al., 2005). Dieser basiert auf dem Segmentierungsverfahren "Active Contours without Edges" (T. Chan, L. Vese, 2001).

Segmentierung

Das Ziel der Segmentierung ist es, eine Kurve C (bzw. eine Menge von Kurven) zu finden, so dass das Innere der Kurve genau die Zellen sind und das Äußere der Kurven genau der Hintergrund ist. Das hier verwendete Verfahren beruht auf der Annahme, dass sowohl die Zellen als auch der Hintergrund je relativ gleichmäßige Helligkeiten besitzen. Anhand dieser Annahme, kann man die Einführung eines Energiefunktionals F motivieren, welches eine innere Energie der Helligkeiten von Hintergrund und Vordergrund darstellt:

Dabei bezeichnet C eine Kurve, c_{in} und c_{out} sind die Durchschnittshelligkeiten im Inneren bzw. Äußeren von C. Um Einfluss auf die Form der Kurve (z.B. Glattheit) nehmen zu können, wurden die beiden vorderen Regularisierungsterme eingeführt. Mu, nu, lambda_{in} und lambda_{out} bilden die vier empirisch einzustellende Parameter des Algorithmus. Das Finden einer geeigneten Kurve ist dann eine Minimierungsaufgabe des Funktionals F bezüglich aller möglichen Kurven C, also

Um einige praktische Vorteile zu erzielen, wählt man anstatt der üblichen Darstellung der Kurve C durch eine Parametrisierung eine Level-Set-Darstellung von C, d.h. C ist die Nullstellenmenge einer Lipschitz-Funktion . Ein möglicher Lösungsansatz des Minimierungsproblems besteht im Lösen der zeitabhängigen PDE

welche die Angabe einer geeigneten Startkurve phi_0 fordert.

Tracking

Zur Vorbereitung des Trackings wird das Startbild segmentiert und jeder Zelle Z_i eine Kurve C_i so zugewiesen, dass die C_i jeweils genau die Z_i umranden. Im Trackingschritt wird dann der Segmentierungsalgorithmus auf das folgende Bild angewendet, mit je den C_i als Startkurven. Dabei pflanzen sich die C_i auf die nächstgelegene Zelle fort. Die Einführung einer zusätzlichen Bedingung verhindert, dass sich mehrere Kurven überlappen. Die Berechnung der neuen C_i erfolgt mittels Energieminimierung des Funktionals bezüglich aller Kurven C_i (bzw. phi_i in Level-Set-Schreibweise)

MasTracker hat folgende Fähigkeiten:

Automatisches Erstellen einer geeigneten Anfangssegmentierung mit Möglichkeit manueller Korrekturen
Robustheit gegenüber Bildrauschen
Automatisches Erkennen von Zellteilungen
Anzeige statistischer Daten der Tracks (z.B. Geschwindigkeit, Zellteilungen), insbesondere mit Auswertung der Kontaktfläche von Zellkontakten und Kontaktzeiten
Leichte Erweiterbarkeit der Auswertungstabellen
Stabiles Verfolgen sich berührender Zellen (falls man rel. konstante Zelldimensionen voraussetzen kann)

MasTracker stellt folgende Grundvoraussetzungen an die Zellbilder: * Partikel brauchen eine gewisse Mindestgröße (je nach Bildqualität ~80-150 Pixel) * Zellbewegungen (von Bild zu Bild) kleiner als Zelldurchmesser

Darstellung der Ergebnisse

Zur qualitativen Auswertung der Ergebnisse des Trackings wird am Ende ein Bild mit den Trajektorien der einzelnen Zellen angezeigt. Die quantitative Auswertung erfolgt mittels einer Tabelle, die Informationen wie Geschwindigkeit, zurückgelegte Distanzen, Zellteilungen, Direktionalität, Polarisierung etc. enthält. Diese Tabellendarstellung ist weitgehend unabhängig vom restlichen Programm geschrieben, kann also leicht auch ohne Kenntnis des kompletten Quellcodes angepasst werden. Praktische Ergebnisse Es standen drei Datensätze unterschiedlicher Bildqualität zur Verfügung. MasTracker lieferte die besten Ergebnisse bei großen Partikeln. Dazu die drei Bespiele:

1. Sehr gute Ergebnisse beim Tracking von Nuklei von Hautzellen (letztes Bild: Spuren der Zellen)

2. Gute Ergebnisse beim Tracking von Nervenzellen im Cerebellum (Mutanttyp)

3. Bilder von Nervenzellen im Cerebellum (Wildtyp) als Beispiel für ungeeignete Bilddaten (Mindestvoraussetzungen an Trackingsoftware nicht erfüllt, da Partikel zu klein.)

Download und Installation

Zum benutzen des Plugins werden folgende Dateien benötigt:

ImageJ (ab Version 1.37)
MasTracker plugin und Handbuch (Quellcode)

Download und Installation

Zum benutzen des Plugins werden folgende Dateien benötigt:

ImageJ (ab Version 1.37)
MasTracker plugin und Handbuch

Installationsanleitung:

ImageJ installieren, MasTrackerWithMTJ.zip entpacken und MasTracker.jar und mtj.jar in das Verzeichnis /ImageJ/plugins schieben. Im Plugins-Menü von ImageJ erscheint dann MasTracker.

Download and Installation

You need the following files:

ImageJ (from version 1.37)
MasTracker plugin and manual

Installation Instructions

Install ImageJ, unpack MasTrackerWithMTJ.zip and move MasTracker.jar and mtj.jar to the directory /ImageJ/plugins. Start ImageJ and choose MasTracker from the plugins menu.

Betreuung:

Prof. Dr. Brigitte Forster-Heinlein, Zentrum Mathematik, TU München
Dipl. Math. Stefan Held, Zentrum Mathematik, TU München
Dr. Reinhard Köster, Institut für Entwicklungsgenetik, GSF Neuherberg